ELISA實驗操作篇之：試劑，標本，操作步驟對結果的影響

酶聯免疫吸附試驗（ELISA） 因其操作簡單，靈敏度高，特異性好，經濟安全等特點而在研究上廣泛應用，但是由于其操作步驟復雜，一般包括試劑準備，樣本收集，加樣，溫育，洗滌，顯色，比色，結果判定等，其中任何一項操作不當都會對檢測結果產生很大影響。因此，必須加強ELISA檢測的全面質量控制，保證其結果的準確可靠。

1 試劑

的試劑是保證檢驗質量的基礎。從4℃冰箱取出的試劑必須放置室溫20～30 min 后再啟用，否則水化層的形成可能影響試劑的原始濃度及試劑中溶質分子的均勻分布。未用完的試劑和質控品應密封并及時放回冰箱保存。根據蛋白質在冷凍過程中出現蛋白分子分布改變的特點，試劑正式啟用前應充分混勻。所用蒸餾水、去離子水和自行配制的緩沖液等，都必須調整其pH 值和離子強度等。不同批次的試劑在制作過程中很難保證質量*一致，因此必須選擇和訂購長批號的試劑，并保證保存條件，嚴格執(zhí)行這一標準可以避免試劑批號改變而重建質控體系及重新評估試劑的復雜過程，并且能夠保證結果的穩(wěn)定性。

2 標本

患者標本中有可能含有干擾試驗的免疫物質，導致假陽性或假陰性的結果，干擾因素一般可分為兩類，即內源性和外源性干擾因素。內源性干擾因素一般包括類風濕因子、補體、高濃度的非特異性免疫球蛋白、異嗜性抗體及某些自身抗體等，避免內源性干擾因素主要通過選擇合適的試劑；外源性干擾因素包括標本溶血、標本被細菌污染、標本貯存時間過長及標本凝固等。要注意避免標本出現嚴重溶血，標本中血紅蛋白中含有血紅素基因，其具有類過氧化物的活性，因此，在以辣根過氧化物酶（HRP）為標記的ELISA測定試驗中，容易在溫育過程中吸附于固相，從而與加入的底物反應顯色。標本在低溫下保存時間過長，IgG可聚合成多聚體，在間接法ELISA測定中會導致本底加深，甚至出現假陽性結果。通常血清標本可在2～8℃保存1 周，冷凍保存時間會更長。血清標本應充分離心，否則可因纖維蛋白原非特異吸附于微孔而造成假陽性結果。冷凍保存標本避免反復凍融，標本的反復凍融會因其所產生的機械剪切力對標本中的蛋白等分子產生破壞作用，使抗體效價下降從而引起假陰性結果。標本的采集及分離要注意盡量避免細菌的污染。此外，標本在凍存時會因蛋白質局部濃縮分布不均，因此重新溶解的標本必須混勻，但不要劇烈振蕩和反復顛倒。

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3 操作因素

3.1 加樣　

加樣器是一種比較精密的工具，其在長時間使用時會因機械磨損或推動桿內附著的血痂等原因造成加樣不準，因此必須定期對加液器進行維護和校準。每次加不同的標本均需更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染；加樣速度不可太快，以免將標本加在孔壁上部，并注意不要濺出或產生氣泡，加樣時還應注意操作時差對結果的影響，尤其對競爭法檢測結果影響更大。因此建議在加酶結合物和底物時用多道加液器，或者雙人同時加樣以減少操作時差對結果的影響，另外有些項目在檢測前需要稀釋以減少非特異性反應。稀釋的方式非常重要，*方式是采用振蕩器混勻，不可隨意改變混勻方式。

3.2 溫育

3.2.1溫育的溫度：育常采用的溫度有43 、37℃、室溫或4℃等。37℃是實驗室中常用的溫育溫度，也是大多數抗原抗體結合的zui適反應溫度?？乖贵w反應一般在37℃經1～2 h 產物的生成可達，為加速反應，可在一定范圍內提高反應的溫度并在反應過程中連續(xù)振蕩來增加抗原抗體接觸的概率?？乖贵w反應在4℃更為*，形成的產物更多、更穩(wěn)定，但因所需時間太長，在ELISA檢測中一般不予采用。

3.2.2溫育的方式：溫育方式常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結果的吸光度差異（即“邊緣效應”）。可將ELISA板置于水浴箱中，板底應貼著水面，使溫度迅速平衡，為避免蒸發(fā)，可用塑料貼封紙覆蓋板孔。若用溫箱，ELISA板應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性良好的材料（如金屬等），在盒底墊濕的紗布，zui后將ELISA板放在濕紗布上。溫育過程中每塊反應板不能重疊放置，防止溫度擴散的不均勻性。

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